大巴不能在高速公路上行驶的时间是凌晨两点至五点。
凌晨2点以后，禁止长途客车从收费站口上高速，对此时间段内正在高速公路上行驶的长途客车就近引导到服务区或客运站停车休息。
机动车在高速公路上正常行驶时，必须遵循下列规定：
1、不准倒车、逆行，不准穿越分隔带掉头或者转弯；
2、不准进行试车和学习驾驶机动车；
3、不准在匝道、加速车道或者减速车道上超车、停车；
4、不准骑、压车道分界线和在超车道上连续行驶；
5、不准右侧超车；
6、除遇障碍，发生故障等必须停车的情况外，不准随意停车、停车上下人员或者装卸货物；
7、除因停车驶入或者驶出紧急停车带和路肩外，不准在紧急停车带和路肩上行车。
综上所述，大客车在凌晨2点到5点之间不能在高速公路上行驶。如果司机夜间在高速上行驶，到了规定的时间之后，没有办法及时下高速，那么则需要在附近安全的地方停下来，在地上休息。
【法律依据】：
《道路旅客运输企业安全管理规范》第三十
客运企业在制定运输计划时应当严格遵守客运驾驶员驾驶时间和休息时间等规定：
（一）日间连续驾驶时间不得超过4小时，夜间连续驾驶时间不得超过2小时，每次停车休息时间应不少于20分钟；
（二）在24小时内累计驾驶时间不得超过8小时；
（三）任意连续7日内累计驾驶时间不得超过44小时，期间有效落地休息；
（四）禁止在夜间驾驶客运车辆通行达不到安全通行条件的三级及以下山区公路；
（五）长途客运车辆凌晨2时至5时停止运行或实行接驳运输；从事线路固定的机场、高铁快线以及短途驳载且单程运营里程在100公里以内的客运车辆，在确保安全的前提下，不受凌晨2时至5时通行。
